冰冻切片观察凋亡IFtunel+IF双标实验步骤-上海郑核
一、实验器材及试剂
1、实验器材
名称 厂家 型号
冰冻切片机 Thermo Cryotome E
载玻片 Servicebio
盖玻片 江苏世泰实验器材有限公司 C
脱色摇床 Servicebio TSY-B
涡旋混合器 Servicebio MX-F
掌上离心机 Servicebio D1008E
移液枪 Dragon KE0003087/KA0056573
组化笔 Gene tech GT1001
冰箱 青岛海尔股份有限公司 BCD-192TGN
正置荧光显微镜 日本尼康 Nikon Eclipse C1
成像系统 日本尼康 Nikon DS-U3
2、主要实验试剂
试剂 厂家 货号
丙酮 国药集团化学试剂有限公司
PBS缓冲液 Servicebio G0002
蛋白酶K Servicebio G1205
破膜液 Servicebio G1204
BSA Servicebio G5001
Tunel试剂盒 Roche
一抗
荧光二抗
DAPI Servicebio G1012
抗荧光淬灭封片剂 Servicebio G1401
二、冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标实验步骤
1、冰冻切片固定：冰冻切片从冰箱拿出来复温，晾干水分，冷丙酮固定10min，待丙酮完全干后于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
2、修复：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止液体流走），在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37度温箱孵育25min。将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、加试剂1,2：按片子数量和组织大小取tunel试剂盒内适量试剂1 (TdT) 和试剂2(dUTP)按1:9混合（试剂1,2为现配现用），加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温孵育2小时，湿盒内加少量水保持湿度。
5、BSA封闭:将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min，在圈内滴加用3%BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min。
6、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗覆盖组织，避光室温孵育50min。
8、DAPI复染细胞核：切片用PBS（PH7.4）洗涤3次，每次5min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
10、镜检拍照：切片于荧光显微镜下观察并采集图像。（DAPI紫外激发波长330-380nm，发射波长420nm，发蓝光；FITC激发波长465-495nm，发射波长515-555 nm，发绿光；CY3激发波长510-560，发射波长590nm，发红光）。
三．冰冻切片荧光tunel+免疫荧光双标结果判读
DAPI染出来的细胞核在紫外的激发下为蓝色，Roche试剂盒为FITC荧光素标记，阳性凋亡细胞核为绿色，一抗标记的阳性细胞为红色
郑核生物优势货源：麦克林全国授权经销商、TCI、阿拉丁、Abcam、CST、三鹰、索莱宝、SIGMA、alfa、ACROS、WAKO、岸田化学、等试剂；病理实验的专业助手，病理切片，HE染色，免疫组化，特殊染色，病理大切片专业的设备，有资质的人员为大家提供动物组织脱水，包埋，制片，染色等病理科研技术服务！多组织包埋、切片、he染色、全景扫描
病理分析、masson染色、免疫组化、WB
免疫荧光、RT-PCR、透射电镜、ELISA
扫描电镜、生化检测收费标准私信，真是实验结果，公司正规运营资质可验查，为病理实验提供有效保障。；优势产品：Roche、BD、santa、R&D、博士德、博奥森、联科、华美、南京建成、Thremo、Millipore、Axygen、NEST、四季青、gibco、百灵威、ELK、abways、BI、bioword、affinity、bioss、欣博盛、PAN、同仁、康为、汇力、天根等;